组织细胞总谷胱甘肽检测试剂盒 E2015--北京普利莱基因技术有限公司
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    组织细胞总谷胱甘肽检测试剂盒 E2015

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    产品名称
    规格
    价格
    E2015

    组织细胞总谷胱甘肽检测试剂盒

    100T
    560元

    描述:组织细胞总谷胱苷肽检测试剂盒(Total Glutathione Assay Kit)是一种灵敏简单的检测总谷胱甘肽的试剂盒。总谷胱甘肽包括还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)。GSH 是细胞中巯基的主要来源,对于维护蛋白巯基适当的氧化还原状态有重要作用,动物细胞中GSH占总谷胱甘肽比例约90-95%。

    原理:GSH可以和DTNB反应生成黄色的TNB和GSSG,利用该反应可以通过测定生成TNB的吸光度(A412nm)定量检测GSH;另外谷胱甘肽还原酶可以将GSSG还原为GSH,在反应体系中增加谷胱甘肽还原酶反应,可以测定总谷胱甘肽,并能通过酶反应将GSSG反复还原为GSH,从而极大提高GSH和DTNB显色反应对GSH检测的灵敏度。本试剂盒以GSH为标准品检测线性范围为1.25-40μM,灵敏度≤1.25μM。

    适用:本试剂盒能够检测动物组织、培养细胞和多种其它生物样本中的总谷胱甘肽含量。

    组成:

    组份名称

    规格

    数量

    总谷胱甘肽检测缓冲液

    50ml/瓶

    1

    还原型谷胱甘肽(GSH)

    6mg/管

    1

    DTNB

    4mg/管

    1

    谷胱甘肽还原酶

    150μl/管

    1

    NADPH

    5mg/管

    1

    蛋白去除试剂S

    0.5 g/管

    1

    组织细胞裂解液

    100ml/瓶

    1

    DMSO

    1.2ml/管

    1

     

    储存条件:-20℃储存,12个月有效。NADPH配制成溶液后,可适当分装,-70℃储存。GSH和DTNB溶解后,-20℃储存。蛋白去除试剂S配制成溶液后4℃储存。

    所需设备:酶标仪,最佳工作波长412nm

    操作步骤:

    1. 样品的准备

    1.1 细胞样品的准备:收集新鲜细胞,PBS洗涤细胞一次,离心收集细胞,吸尽上清。加入

    200 μl的预冷的组织细胞裂解液,冰浴匀浆或超声裂解细胞。4℃,10000g离心10分钟。取上清和蛋白沉淀试剂S溶液1:1混合并涡旋。4℃,10000g离心10分钟。取上清用于总谷胱甘肽的测定。不立即测定的样品可以-70℃保存。如果样品中总谷胱甘肽超出测定范围,可利用蛋白沉淀试剂S溶液适当稀释后测定,稀释倍数可达10-20倍。

    1.2 组织样品的准备:利用含1mMEDTA的PBS灌流或漂洗组织,去除组织中的血液,然

    后取约20mg组织,加入400μl的预冷的组织细胞裂解液,冰浴匀浆。4℃,10000g离心10分钟。取上清和蛋白沉淀试剂S溶液1:1混合并涡旋。4℃,10000g离心10分钟。取上清用于总谷胱甘肽的测定。不立即测定的样品可以-70℃保存。如果样品中总谷胱甘肽超出测定范围,可利用蛋白沉淀试剂S溶液适当稀释后测定,稀释倍数可达10-20倍。

    2. 试剂盒的准备

    2.1 GSH储备液的配制:在本试剂盒提供的6mg GSH中加入1ml的纯水,溶解并混匀,即为GSH储备液,浓度为20mM。

     2.2 DTNB储备液的配制:在本试剂盒提供的4mg DTNB中加入1ml本试剂盒提供的DMSO溶解并混匀,即为DTNB储备液,浓度为10mM。

     2.3 NADPH储备液的配制:在本试剂盒提供的5mg NADPH中加入1ml纯水,溶解并混匀,即为NADPH储备液,浓度为5mg/ml。

     2.4 总谷胱甘肽检测工作液的配制:根据待测样品数参考下表配制适当量的总谷胱甘肽检测工作液,表中试剂按比例混合后即为总谷胱甘肽检测工作液。

     

    1个样品

    10个样品

    50个样品

    总谷胱甘肽检测缓冲液

    150μl

    1.5ml

    7.5ml

    DTNB储备液

    5μl

    50μl

    250μl

    谷胱甘肽还原酶

    1μl

    10μl

    50μl

     

    2.5 NADPH工作液的配制:取NADPH储备液,利用总谷胱甘肽检测缓冲液稀释10倍,配制为0.5mg/ml的NADPH工作液。每检测一个样品需要50μl的0.5mg/ml NADPH。

    3. 标准品的准备

    将20mM的GSH储备液用蛋白去除试剂S溶液稀释成20、10、5、2.5、1.25、0.62μM浓度的GSH溶液,用于标准曲线测定。由于GSH在蛋白去除S溶液中不够稳定,每次测定需新鲜配制系列标准品稀释液。

    4、测定方法

    4.1 参考下表,使用96孔板,依次加入总谷胱甘肽检测工作液、样品或标准品后,混匀,25℃或室温孵育2分钟。

     

    空白对照

    标准曲线

    样品

    总谷胱甘肽检测工作液

    150 μl

    150 μl

    150 μl

    标准品

    10 μl

    样品

    10 μl

    蛋白沉淀试剂S溶液

    10 μl

    25℃或室温孵育

    2 min

    2 min

    2 min

    NADPH工作液

    50 μl

    50 μl

    50 μl

    25℃孵育

    20 min

    20 min

    20    in

     

    4.2  参考上表,各孔加入NADPH工作液50μl,25℃孵育20分钟。

    4.3 各孔加入NADPH工作液50μl启动谷胱甘肽还原酶反应后,立即开始计时,并在5、10、20分钟等时间点测定A412nm。如果样品吸光度较低,可适当降低标准品浓度,延长反应时间进行样品测定。

    5. 数据处理

    利用GSH标准品浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标制作标准曲线,并获得横纵坐标之间的函数关系式,然后利用标准曲线和各样品的吸光度值计算样品的总谷胱甘肽浓度。由于有多个时间点的标曲,可以选择标曲线性最好的时间点计算样品总谷胱甘肽浓度。GSH标曲测定如下图所示:

    参考文献

    1.Akerboom, T.P., and Sies, H., 1981. Assay of glutathione, glutathione disulfide, and glutathione mixed disulfides in biological samples. Methods Enzymol., 77, 373-382.

         2. Nair, S. et al., 1991. Flow cytometric monitoring of glutathione content and anthracycline retention in tumor cells. Cytometry, 12, 336-342.

    注意事项

    1. 本试剂盒检测涉及氧化还原反应,很多氧化剂和还原剂都会干扰试剂盒的测定,特别是巯基乙醇、DTT等含有巯基的试剂会严重干扰本试剂盒的测定,请尽量避免。

    2. 严格控制反应的温度和反应时间,并在每次测定同时利用标准品制作标准曲线,样品中谷胱甘肽浓度过低时,可适当延长反应时间。

    3. NADPH在溶液中容易分解,要严格按储存条件保存。

    4. 初次使用试剂盒时,粉末试剂和小体积液体试剂请适当离心后使用。

    5. 本产品仅限专业人员用于科学研究,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品。

         6. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

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